目的

探讨药物诱导亚低温对缺血性脑卒中急性期损伤的神经保护作用及线粒体裂变动力相关蛋白1（DRP-1）调控线粒体功能在其中的潜在分子机制。

方法

45 只雄性SD 大鼠随机分为3 组，假手术组（sham 组）、大脑中动脉栓塞模型（MCAO）组和MCAO 模型+腹腔注射氯丙嗪联合异丙嗪（C+P）组，每组15 只。构建SD 大鼠2 h MCAO 模型，再灌注后即刻腹腔注射8 mg/kg C+P，并在再灌注后2 h 补充1/3 C+P 药量。在建立MCAO 模型前测量大鼠基础体温，并在腹腔注射C+P 药物即刻、给药后5 min、10 min、20 min、30 min、1 h、2 h、3 h、6 h、12 h 和24 h 分别测量大鼠体温。再灌注48 h 后应用三苯基氯化四氮唑（TTC）染色评价脑梗死体积；应用Ludmila Belayev 12 分和Longa 5 分评分评价短期神经功能缺损程度；再灌注后24 h 应用TUNEL 染色检测缺血半暗带细胞凋亡情况；并且应用ELISA 检测乳酸脱氢酶（LDH）、死亡细胞、ATP、活性氧（ROS）及线粒体呼吸链复合体（COX I-Ⅳ）的水平，评价细胞损伤情况和线粒体功能；此外，再灌注后24 h 应用实时荧光定量聚合酶链式反应和蛋白质印记法检测DRP-1 和线粒体裂变1 蛋白（Fis-1）的表达，评价线粒体裂变水平。多组间资料比较采用单因素方差分析，采用LSD-t 检验或Dunnett's T3 法进行组间两两比较。

结果

再灌注即刻给予C+P 能够诱导大鼠亚低温状态，5 min 内大鼠体温迅速下降，2 h 后体温降至最低［（33.5±0.3）℃］，12 h 后体温恢复至正常水平。与MCAO 模型组比较，C+P 组大鼠脑梗死体积降低［（29.73±2.32）% vs（48.46±0.48）%］，短期神经功能缺损程度降低［Longa 5 分评分：（2.0±0.1）分 vs（4.0±0.1）分；Ludmila Belayev 12 分评分：（5.0±0.3）分 vs（8.0±0.2）分］，差异均具有统计学意义（5 分评分t=2.917，P=0.008；12 分评分t=2.475，P=0.029）。同时，与MCAO 模型组相比，C+P 组LDH、ATP、ROS 及线粒体呼吸链复合体（COX I-IV）的水平降低，细胞凋亡和死亡细胞减少，差异均具有统计学意义（P 均＜0.05）；此外，与MCAO 模型组相比，C+P 组DRP-1 磷酸化和Fis-1 的mRNA 和蛋白表达水平降低，差异均具有统计学意义（P 均＜0.05）。

结论

C+P 诱导的亚低温通过抑制DRP-1 磷酸化和Fis-1 表达，抑制线粒体裂变，减轻线粒体功能障碍，减少细胞凋亡，在缺血性脑卒中后发挥神经保护作用。

Objective

To investigate the neuroprotective effect of drug-induced hypothermia in acute phase of ischemic stroke， as well as to elucidate the underlying mechanism involving DRP-1-mediated mitochondrial function.

Methods

A total of 45 adult male Sprague-Dawley rats were randomly assigned to three groups： sham operation （Sham）， middle cerebral artery occlusion （MCAO）， and MCAO with chlorpromazine and promethazine treatment （C+P） （n=15 per group）.Rats underwent 2 h of MCAO followed by 24 h or 48 h reperfusion.C+P was administered at the onset of reperfusion at a dose of 8 mg/kg，with one-third of the original dose injected 2 hours later to potentiate the drug's effects.Body temperature was monitored at pre-MCAO， initial drug， and 5 min， 10 min， 20 min， 30 min， 1 h， 2 h， 3 h， 6 h， 12 h， 24 h after administration.Infarct volumes and neurological deficits were assessed using 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride （TTC） staining and scoring systems at 48 hours.TUNEL staining was used to detected the apoptotic cell death at 24 h.The lactate dehydrogenase （LDH）， cell death， ATP， reactive oxygen species （ROS）concentration， and mitochondrial respiratory chain complex （COX Ⅰ-Ⅳ） were evaluated by ELISA at 24 h.The mRNA and protein expressions of DRP-1 and Fis-1 were quantified by qPCR and western blotting at 24 h.LSD-t test or Dunnett's T3 method were used for inter-group comparisons.

Results

C+P administration（8 mg/kg） significantly reduced body temperature within 5 minutes post-MCAO in rats， reaching the lowest temperature ［（33.5±0.3） ℃］ after 2 hours， and maintaining a significantly reduced temperature for up to 12 hours before returning to normal.Compared to the MCAO group， C+P significantly reduced infarct volumes ［（29.73±2.32）% vs （48.46±0.48）%］ and neurological deficits［5 score： （2.0±0.1） vs （4.0±0.1）；12 score： （5.0±0.3） vs （8.0±0.2）； （5 score： t=2.917， P=0.008； 12 score： t=2.475， P=0.029）］.C+P also significantly mitigated mitochondrial dysfunction （LDH， ATP， ROS and COX I-IV） and cell death apoptosis（P＜0.05）.mRNA and protein expression of DRP-1 and Fis-1 were both significantly reduced by C+P（P＜0.05）.

Conclusion

Our findings suggest that C+P-induced hypothermia exerts neuroprotective effects after ischemic stroke by inhibiting DRP-1 phosphorylation and Fis-1 expression， and reducing mitochondrial dysfunction and apoptosis.